《临床质谱原理与应用》（美）内德·里法伊等主编，潘柏申主译|(epub+azw3+mobi+pdf)电子书下载

图书名称：《临床质谱原理与应用》

【作　者】（美）内德·里法伊等主编，潘柏申主译

【页 数】 244

【出版社】 上海：上海科学技术出版社 , 2020.05

【ISBN号】978-7-5478-4839-5

【价 格】198.00

【分 类】临床医学-质谱法

【参考文献】 （美）内德·里法伊等主编，潘柏申主译. 临床质谱原理与应用. 上海：上海科学技术出版社, 2020.05.

图书封面：

图书目录：

《临床质谱原理与应用》内容提要：

本书由Elsevier于2018年出版，全面介绍了各类色谱和质谱分析技术的基本原理、临床应用方向、标本制备、检测方法的建立与验证等，指导临床工作人员（特别是初学者）如何选择适合目标分析物的分析仪器、如何建立检测方法，并进行性能确认、确认与质量控制，同时又全面介绍了各类质谱技术在临床病原微生物、小分子代谢物及蛋白组谱检测中的优势与前景。主要读者对象为从事色谱与质谱分析技术临床应用工作的人员，包括有设想开展色谱与质谱临床应用检测的实验室管理人员、色谱与质谱分析技术初学者以及在该领域有一定专业基础和应用经验的工作人员。

《临床质谱原理与应用》内容试读

第1章·色谱

David S.Hage*

要

背景

临床试验通常涉及使用一个或多个步骤将目标化合物与样品中的其他化学物质进行分离、富集或区分。色谱是实现这种分离最常用的方法之一。这种方法是基于混合物中的不同组分与支持材质提供的流动相和固定相之间的不同化学或物理相互作用来实现分离。由于该方法所使用的流动相、固定相和载体大相径庭，色谱会有多种形式。这也使得该技术用途广泛。

内容

本章介绍了色谱的基本原理及这种方法用于化学分析的各种方式和制备其他技术检测的样品。讨论了气相色谱、液相色谱、平面色谱、超临界流体色谱和多维分离技术，每一种方法使用的流动相、固定相和载体，以及这些方法中使用的仪器和检测流程。

生物液体样本是复杂的化学物质混合物。这意味着，临床检测这些液体中的特定成分往往涉及使用一个或多个步骤将样本中的目标化合物进行提取、富集或分离。色谱是实现这种分离最常用的方法之一。

色谱基本原理

相高度保留。同那些与固定相相互作用较弱的

■色谱的基本术语与组件

组分相比，高度保留的组分通过该系统的时间

色谱是一种分离混合物组分的方法。这种更慢，而在流动相中停留的时间更长。这导致方法是基于混合物中不同组分流动相和固定相不同组分在通过色谱系统时的移动速度存在差之间的不同化学或物理相互作用的差异来实现异，从而实现分离。分离4。经典色谱系统的基本组成和操作如

图1.1所示的色谱系统使用包含固定相和载

图1.1所示。样品充入或注入后，流动相就会携体的色谱柱（或管，同时流动相和样品也可通带样品成分流过整个系统。固定相由一个载体过该系统。1903年Mikhail Tswett首次描述了这固定在系统内。当样品的各组分通过该系统时，种方法。他采用装有碳酸钙作为载体和固定相样本中与固定相相互作用最强的组分将被固定的色谱柱将植物色素分离成彩色条带s)。Tswt

Drs.Glen L.Hortin,Bruce A.Goldberger,M.David Ullman,Carl A.Burtis,

Larry D,Bowers在本章先前版本编写中做出的贡献。

002临床质谱原理与应用·小分子，多肤和病原体

几流动相

用于进行色谱分离的仪器称为色谱仪[7.0如气相色谱使用的是气相色谱仪，液相色谱使

色谱柱

用的是液相色谱仪。这些仪器以洗脱时间或通过系统的流动相的体积来提供与从柱中流出(或洗脱)的相关化合物量的响应信号。得到

载体和

固定相

的响应信号相对于时间或体积的图被称为色谱图7.01（图1.1和图1.2）

流动相经过的时间或体积

图1.1色谱系统的常规组成部分，用色谱柱分离两种化学物质

A和B

称这种方法为色谱。这个名字来源于希腊语中的“chroma and graphein'”,意思是“颜色”和“书写”。这个术语至今仍用来描述这种技术，即使大多数现代色谱分离不涉及有颜色的样品成分

Tswett所使用的色谱被称为“柱色谱”，其

农

固定相和载体被固定在圆柱内。色谱中的固定相可以是载体的表面，也可以是载体表面包被

2

时间(min)

的物质，或是被交联或键合到载体上的化学

色谱柱：C18,3um,0.46cm×10cm

层26。在柱色谱中，载体可以是色谱柱的

洗脱：等度，0.025moL磷酸盐缓冲液：25%乙腈，pH3.0

内壁或填充色谱柱的材料。柱色谱是最常用的

流速：2 mL/min

检测：215nm,0.1AUFS

色谱形式。然而也可以使用平面或开放表面作

化合物：1.多虑平

为载体和固定相，这种形式被称为“平面色谱”，

2.去郁敏

3.丙咪嗪

将在本章后面更详细地对其进行讨论2。

4.去甲替林

5.阿米替林

色谱可基于所使用的载体类型进行分类；

图1.2基于反相色谱和高效液相色谱分离三环类抗抑郁

如柱色谱和平面色谱。色谱也可以根据使用的

药的色谱图。使用吸光度检测器进行检测，该检测器检测

流动相进行分类，如使用气体流动相的色谱称

215nm处的柱洗脱。注意：信号显示为以0.1吸光度单位满刻度(absorbance units full scale,.AUFS)。

为气相色谱(GC)[,使用液体作为流动相的

(图片来源于：Courtesy Vydac/Grace Materials Technologies.

色谱称为液相色谱(LC)9。色谱也可以根据

Columbia,Maryland..）

固定相的类型进行分类，或者根据固定相与样

特定化合物通过色谱柱所需的平均时间或

品组分相互作用的方式进行分类，如GC法中的

平均体积称为该化合物的保留时间()或保

气固色谱(GSC)或气液色谱(GLC),以及LC留体积('.)。这些值随着化合物与固定相相互

中的吸附液相色谱、分配色谱或离子交换色谱

作用的强度和程度而增加。未保留或不与固定

(EC)。上述类型及其他色谱也将在本章进行

相相互作用的化合物的洗脱时间或体积称为死

讨论。

时间()或死体积(')。如果用死时间或死

第1章·色谱003

体积对保留时间或保留体积进行校正，则所得时间和调整保留体积)来描述这些差异之外，到的保留时间或保留体积的结果被称为调整保

表示色谱保留的另一种方式是使用保留因子

留时间(1'，其中1'=t®一t)或调整保留体积(k)。这个术语有时也表示为k或称为容量因

(V',其中V='R一V)。对于需要用色谱分离的子7.。保留因子是化合物在固定相中保留

两种化合物来说，它们的和'（或'和''）的平均时间与其在流动相中保留时间的比值。必须具有不同的值27，o1

这个值可以通过使用下列公式从实验数据中计

用柱色谱法进行分离的大多数化合物可通

算出来[2.7,10

过对色谱系统注入相对小体积或量的样品实现。

=(1R-i)/i=（tR)/i

色谱图由一系列代表样品中不同化合物的峰组成。这些峰从色谱柱中分别被洗脱出来。每个

或

峰的保留时间或保留体积可用于帮助鉴定洗脱

k=(VR-VM)/V=(VR)/VM

的化合物。峰的面积或高度可用于定量。

色谱图中每个峰的宽度也是有意义的。峰

如这些公式所示，保留因子是没有单位

宽反映了色谱系统的分离性能或效率。色谱图

的。其值为0，表示化合物和固定相之间没有

中峰的宽度通常由其基线宽度(W。)或其半高发生结合或相互作用，或者该化合物在无效时

宽度(W)表示（图1.3）21.o。若色谱图中

间内被洗脱出系统。化合物与固定相发生更大

峰的宽度更尖锐，则表面色谱系统更容易分离的相互作用将导致其保留时间加长和k值增加。与系统有类似相互作用的两个峰，并且能在一理想的k值需在1~10之间，以实现在不需要定时间间隔内分离更多的峰。相较于宽峰值，过长洗脱时间的情况下对化合物进行合理区分。尖锐峰值更容易被检测，有利于增强灵敏度。

可以从以下几个方面来表明保留因子在描述化合物在色谱中的保留是有用的。首先，k值

IR.B

R.A

应该与流速和柱的尺寸无关。其次，k值与化合物和固定相或流动相之间发生的相互作用的强

R。=(细B-RA)

度直接相关。k值也与柱中存在的固定相和流动

进样点

(Wo.B WpA)/2

相的相对量相关。该特点可通过以下公式来说明。化合物在色谱系统中是根据其在流动相和固定相之间分配的能力而被分离。其他类型的分离机制也是这样类似的关系2。

Wo.A

Wo.B

k=Kp (Vs/VM)

图13该图为使用色谱柱时常见的色谱图，化合物B比化

合物A晚洗脱。R,分辨率；，死时间；，A和R.,溶质

A和B的保留时间；W。.A和R.,化合物A和B的基线峰宽

在这种关系中，k值与以下两点直接相关：

①分析物在固定相与流动相的分配情况，分配

系数(K,；②柱中固定相的量（这里用表

■保留和选择性

示)与流动相的量（如由'表示死体积）的比

需要通过色谱分离的两种化合物在与固定值（分配比）。K,值的增高（化合物进入固定相

相和流动相的相互作用方面需要有一定差异。的趋势比流动相更大)，或被称为分配比的(V'

除了使用保留时间和保留体积（或调整保留'）比值增高，都可使k值增高。

04临床质谱原理与应用小分子、多肤和病原体检润

色谱中的任何分离都要求被分离化合物

记忆要点

的保留特性彼此间有一定差异。描述这种保留差异的一种方法是使用分离因子或选择性因子

影响色谱效率的因素

(α)7.0。两种化合物(A和B)的分离因子

色谱柱长度[影响理论塔板数(N),但

等于它们保留因子的比值（k、和k)。

不影响塔板高(H)]。

·载体的粒径（填充床柱）或管径（开口

a=kw/ka

管柱)。

其中后被洗脱组分的保留因子是分子。如

·载体的尺寸、性状和包装的一致性。

果两种化合物在色谱系统中具有相同的保留值，

·流速和线速度。

则值将等于1且不可被分离。如果A和B的

·温度和溶质扩散速率。

峰具有不同的保留因子，则值将大于1，并

·流动相黏性。

且随着分离程度的增加而增加。

·化合物保留程度。

被分离的化合物及色谱系统中的固定相

·初始进样量。

和流动相决定其保留因子和选择因子值。当目标是将一种化学物质与样品中的其他化合物

·除色谱柱外，连接管、检测器和系统组件

选择性地区分开来时，则需要较大的保留时

的体积。

间与分离因子差异。然而，当使用色谱系统从同一样品中分离几种化合物和峰时，所需的

色谱系统中带宽的效率和程度与最终实验

保留和分离因子差异较小。在这种情况下，许上观察到的化合物峰的宽度相关。这个宽度可多色谱常见类型中的α值为1.1或更大，表示

以用诸如峰的基线宽度(W。)、半高宽度(W)

足够分离。然而，产生宽大峰的色谱方法可或峰的标准偏差（σ）等参数来描述。还可以用能需要更大的α值才能将两种化合物很好地

另一种理论塔板数或塔板数(N)来表示色谱的

分离。

分离效率。任何类型色谱峰的值都可以通过以下公式计算：

■带宽程度与有效性

实现分离除了需要保留时间存在差异之外，

N=(1R/o)2

两个化学物质的相邻峰必须足够窄以便观察到

其中是峰的保留时间，σ是峰的标准偏

这种差异。当峰通过色谱系统时，即使仅注入小体积样品，峰宽或带宽也会增加。化合物在

差，其与的单位相同.0。该方程对于高斯

通过或在载体中时，在流动相和固定相之间或

峰型具有以下两个等效形式[2.

之中时，与其移动或扩散速度有关的各种过程

N=16(1R/W)2或N=5.545(tg/W)2

都可导致其峰的变宽。此外，这些带宽变化过程受诸如色谱系统内载体的直径或类型、流动

最后两个等式利用这样的事实，即高斯峰

速率、流动相和固定相中化学品的扩散系数及

型具有基线宽度，该基线宽度通过基线与沿着

化学品保留程度等因素影响（表11）。总之，

峰的任一侧的切线的交点检测，其等于4σ，并

这些过程和因素决定了整体效率或所获得的带

且半宽度等于2.355σ。

宽程度。

当这种化学品已经通过色谱系统时，N值

第1章·色谱005

可代表化合物在流动相和固定相之间分配的有

带宽的过程，如涡流扩散和流动相质量转移。B

效次数。较大N值代表有许多这样的次数，这

代表纵向扩散作用于板高，这一过程随着流速

使得保留时间只有很小差异的两种化合物之间

和线速度的降低变得更加重要。最后，C代表使

更容易被区分。实验中，较大N值可导致高色

H值随着流速或线性速度的增加而增加的过程。

谱效率和尖锐的峰。这更适合用于分离具有相构成C的过程是停滞的流动相质量转移和固定

似保留时间的化合物或快速分离同一样品中的相质量转移。van Deemter方程预测，这些带宽许多化合物。

过程的综合效应将是最佳的流速和线速度范围。

还有其他几种可以描述色谱系统效率的方在此范围内可得到最低板高和最佳效率"。实

法。一种方法是使用色谱系统每单位长度(L)际上，色谱改变流速的目的通常是为了确定那

的理论塔板数(N),并得到他们的比率(NL)。些在最短分离时间内提供足够分辨率来分离样

由于N值与用于色谱分离的色谱柱或载体的长品中的峰的条件。

度成正比，这个比例有助于比较不同长度的系

表1.1列出了影响色谱效率的几个因素。例

统。尽管这意味着更长的色谱系统总是会导致如，可以通过使用较长的色谱柱来提高效率。

更大的N值和更高的效率，但使用更长的系统这可以提高N值，但不会改变H值。这也可以

也会导致更长的分离时间。

将流速调整到最佳值，使用较小直径的载体颗

描述色谱柱效率的另一种方法是理论塔板粒，使用无孔或薄膜颗粒代替全多孔载体颗

或塔板高度的等效高度(HETP或H)[7。H粒，或者使用相对较窄直径的包被毛细管代替

值是通过将色谱系统的长度除以该系统的理论

填充层柱。所有这些因素都有助于降低H值，

塔板数得到的。

从而增加一定长度的色谱柱或色谱层的N值。

然而，这些取决于实验参数中有多少是可以被

H=L/N

改变的。例如，载体颗粒直径的减小可导致更高的效率，但是它也会导致整个色谱系统的背

H值表示柱的长度，或构成一个化学物质

景压力较高，或需要使用较低的流速，或者两

在流动相和固定相之间的理论塔板或分配步骤

者兼而有之。

的色谱系统的长度。尽管N(或NL)值大表示

色谱系统效率高，但相同的系统的H(或L/N)

■分辨率和峰值容量

值相对小。

如图1.3所示，可以通过使用分辨率(R)

使用H来描述色谱效率的价值在于它直接

来描述色谱中分离两个峰的总体程度。两个相邻

与影响带宽的参数和过程相关。一个常见的例

峰之间的分辨率可以通过下面的公式得出[7.。

子是van Deemter方程，它显示了H的整体值如何受到流动相线速度(“)的影响，而这又

（IRB-1RA）

R-

与流动相的线速度与流速(F)通过关系式=

（W.B+W,A）/2

(F×L)/WM直接相关[o.2

在此等式中，RA和RB分别为化合物A

H=A+B/u+Cu

和B(其中B在A之后洗脱)的平均保留时间，

W,A和W,B是这些化合物的峰的基线宽度（在

这个方程中的A、B和C是代表带宽中几种这种情况下，以时间为单位)。另有用A和B

常数。例如，A代表与线性速度和流速无关的的保留体积及以体积为单位的基线宽度来表

0O6临床质谱原理与应用一小分子、多肽和病原休检测

述的等效方程式。两种公式得到的R均无单子，N是色谱系统的理论塔板数。这种关系表

位，它表示用于分离两个峰中心的平均基线宽

明，可以通过以下三种方式来改变色谱中两个

度数。

峰的分辨率：①N代表可通过改变系统的效率

图1.4显示了随着这些峰值的R值增加，

改变分辨率：②k代表可通过改变峰值保留的

分离两个相邻峰的变化。当峰与峰之间没有被总体程度改变分辨率；③α代表可通过改变分离并且它们具有完全相同的保留时间或保留个化合物与另一个化合物的柱的选择性改变分

体积时，R值为0。峰值分离程度随着R值的

辨率。N的增加（如通过使用较长的色谱柱来获

增加而增加。通常认为1.5或更大的R值表示得)将导致R的增加，这与N2成比例。保留因

两个相同大小的峰或基线分辨率之间的完全分子(k)或选择性(a)的增加也会导致分辨率离。但是在许多情况下，1.0或1.25和1.5之间

的非线性增加。

的分辨率值也可能已经足够分离，特别是峰大小

描述色谱分离的另一种方法是峰容量。理

相同且使用它们的峰高而不是峰面积来检测时。

论上，在单次色谱分离过程中，峰容量是可以

可以使用几种方法来改变或提高色谱中两分离的峰（或样品组分）的最大数量。峰容量个峰之间的分离度（图1.5）。这些方法由以下公

的值可以通过假设存在由平均基线宽度（或4倍

式表示，其有时被称为色谱的分辨率方程5。

标准偏差)分离的峰的连续分布确定。实际上，

R=[(N2)4]×[(a-1)1a]×[k/(1+k)]

原始色谱图

在该等式中，k是两个相邻峰中第二个峰的保留因子，α是第一和第二个峰之间的分离因

A

增效效应

R3=0.50

B

Rs=1.00

增加选择性的效果

R=1.50

保留时间（或体积）

图1.5选择性和效率对色谱峰分辨率的影响。这三种情况分别

图1.4对于以1：1面积比存在的两个色谱峰获得的分离度随

为：A.相邻两个峰之间分辨率较差或中等；B.由于柱效高，峰

着这些峰之间的分辨率(R)的变化而变化

之间分辨率较好；C.由于柱选择性好，峰之间分辨率较好

···试读结束···