《核酸疫苗》孙树汉主编|(epub+azw3+mobi+pdf)电子书下载

图书名称：《核酸疫苗》

【作　者】孙树汉主编

【页 数】 295

【出版社】 上海：第二军医大学出版社 , 2000.05

【ISBN号】7-81060-078-8

【价 格】41.00

【分 类】核酸(学科: 疫苗 学科: 研究) 核酸 疫苗

【参考文献】 孙树汉主编. 核酸疫苗. 上海：第二军医大学出版社, 2000.05.

图书目录：

《核酸疫苗》内容提要：

本书系统地阐述了与核酸疫苗相关的免疫学基础与其免疫机制，介绍了从疫苗的构建到临床前研究的相关理论、策略和具体的技术方法，全面地反映了当今国际上核酸疫苗研究的最新进展。

《核酸疫苗》内容试读

第一章概论

核酸疫苗技术作为一种新的免疫接种手段问世不久就在感染性疾病及肿瘤的防治中显示出巨大的潜力。所谓核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质

粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，

引发免疫反应。在1994年5月的世界卫生组织会议上，与会专家充分肯定了核酸疫苗应用的潜在价值，并认为核酸疫苗的研究与未来实施的用一种疫苗预防多种传染病的计划是一致的。大量的实验结果表明，核酸疫苗不仅可用于人类疾病，而且还可广泛应用于人畜共惠病和动植物疾病。它不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。因此，在不久的将来，核酸疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。

第一节研制核酸疫苗的理论依据

自从英国医生Jenner用牛痘苗(1798年)预防天花并获得成功以来，科学工作者又陆续研制了炭疽(Pasteur,1881年)、卡介苗(1923年)等30余种减毒、灭活疫苗。这些疫苗现被称为第一代疫苗。随着现代生物学技术特别是基因工程学技术的不断完善，人们又研制了乙型肝炎亚单位疫苗等第二代疫苗并陆续用于各类传染病的预防。上述疫苗在人类疾病防治过程中发挥了很大作用，但是也存在着诸多不足。减毒、灭活疫苗的潜在致病性和亚单位疫苗免疫反应的不完全性迫使人们继续寻找更为理想的免疫接种剂。

1990年Wolff等注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数月，甚至持续终生，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。1991年Williams等发现输入的外源基因在体内的表达产物可诱导免疫应答。1992年Tang等的实验进一步证实了Williams等的这一发现。1993年Ulmer

等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白(NP)的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗

不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件

下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。于是，核酸疫苗技术应运而生，并逐渐

地显示出它作为第3代疫苗的优越性。

核酸疫苗可以诱导产生体液和细胞介导的免疫反应。在多种疾病的动物模型上证实这些反应是具有保护性的。用含血凝素(HA)编码基因的质粒DNA肌肉注射2次、每次1g,就可以完全保护小鼠免受致死量同源病原体的进攻。给小鼠肌肉注射编码狂犬病毒糖蛋白的质粒

DNA可以保护小鼠在注射5倍LD50剂量的狂犬病毒时免于死亡。

抗体反应是发挥免疫保护作用的主要免疫反应之一。首先被证实的对于蛋白质的抗体反

应是鼠和非人类灵长目动物针对流感病毒蛋白质的抗体反应。同样，含有编码A型流感病毒

的血凝素基质蛋白与核蛋白，以及HV的gpl20和gp160、牛疱疹病毒的giV、狂犬病毒表面糖蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒核心蛋白、丁型肝炎病毒表面抗原、淋巴细胞性

脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的NP、棉尾兔乳头病毒(CRPV)的主要外壳蛋白和单纯疱疹病毒

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(HSV)的gB和gD的质粒DNA在肌肉注射后也可以诱导机体产生抗体。病毒中和抗体的反

应可以抵抗流感病毒HA、HIV、狂犬病毒、CRPV和HSV的攻击。通过向非洲绿猴肌肉注射

编码流感病毒HA的DNA可获得4个月或更长时间的持久性抗体反应。用黑猩猩作人乙肝

核酸疫苗的实验结果显示，在给一只雌性黑猩猩注射2g乙肝核酸疫苗，而给另一只雄性黑猩猩注射400g乙肝核酸疫苗后，前者可检测出效价显著(>100IUL)的抗HBsAg抗体，而后者可检测出效价很低(<60IUL)的抗HBsAg抗体。尽管DNA扩散效率的不同可能对免疫应答的水平带来一些影响，但注射量的差别却可在较大程度上影响诱生的抗体效价。此外，诱生抗体的效价不仅同一次注人的疫苗量有关，也与免疫接种的次数、途径、局部组织状况及个体情况有关。

细胞介导的免疫应答反应是核酸疫苗诱导机体抵抗病原攻击的又一主要机制。其中，

CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活及对靶细胞的杀灭是疫苗发挥保护作用最主要的机

制之一。CTL识别与主要组织相容性复合体I类分子（即MHCI类分子）相连接的长度为

9~11个氨基酸的抗原肽。这样，由DNA产生的蛋白抗原可以通过MHCI类分子进入抗原

提呈途径。这是一种常被活的减毒病毒、重组病毒载体和细胞内细菌使用的抗原提呈系统。这种抗原提呈机制一般不被亚单位蛋白疫苗或灭活的病毒疫苗所使用。由于核酸疫苗在这方

面的特点，它可被用来代替危险性大的活性病毒减毒疫苗。肌肉注射编码LCMV抗原的质粒

DNA小鼠的脾或淋巴结细胞在体外用抗原、分裂素、IL2刺激或在体内用LCMV感染时，可

以很容易地检测到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的存在。针对H-2限制的多肽抗原决定簇（俗

称表位)的特异性效应CTL已经通过用编码流感A病毒NP、乙肝病毒表面抗原和HIV包膜

蛋白(env)的DNA免疫小鼠或用编码HIV(env)的DNA免疫灵长目动物的实验而得到证实。

Umer等用流感病毒，Wang等用HIVgp 160重组体疫苗，Xiang等用牛痘病毒、腺病毒和狂犬病毒的糖蛋白重组体以及Yokoyama等用LCMV都证实了CTL能够识别和杀死被病毒感染的靶细胞。研究小鼠流感病毒的NP时发现肌内注射1g的NP的DNA就可以诱导产生抵

抗流感病毒的CTL。在其他的研究中发现，在用流感病毒NP的DNA免疫后，抗NP的CTL

可以持续存在2年多。肌肉注射一次表达HBsAg的DNA可以更迅速诱生比注射重组HBsAg更强、更持久的体液和细胞免疫反应。

第二节核酸疫苗应用研究的进展

一、核酸疫苗研制的技术路线

若要了解核酸疫苗的研究进展，可在英特网上浏览专门网页，其网址为http:/wuw,genweb.com/dnavax/dnavax.htwl。Whalen博士提出的自我帮助程序已被多数学者所接受，现介绍如下：

(1)目的基因的选择：须确认目的基因序列中是否含有多余的内含子，该内含子在哺乳动

物细胞内是否影响外显子在转录成RNA时的连接，如果候选基因片段是PCR产物，须经测

序得到确认。

(2)选择合适的真核质粒表达载体：载体需含有真核启动子(CMV、R1V、SV40等)，质粒

DNA不能整合到宿主细胞染色体并能持续稳定地表达目的基因，CpG基元(motif)序列可增强免疫。现一般选择含CMV启动子的pcDNA3作为表达载体。

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(3)将目的基因与表达载体相连，构成重组子。提取重组子后用离子交换层析法纯化。

(4)转染哺乳动物细胞检测相应蛋白质的表达。

(5)可选择含有报告基因的表达载体作对照，分析转入的DNA是否表达，报告基因可为

B半乳糖苷酶基因或绿色荧光蛋白基因。

(6)疫苗接种方式和剂量。针对小鼠，可采用直接肌肉注射(100g次)、脂质体包被或将DNA包被金颗粒后用基因枪射入表皮(0.5g/饮)等。

(7)疫苗接种部位。疫苗可经肌肉、皮下或粘膜（如鼻腔滴人）等途径接种。不同接种途径

免疫效果不同，主要是与不同宿主细胞的DNA摄人和表达高低及转染细胞将抗原提呈给免

疫系统的能力有关。导入再生肌肉组织或利用高渗蔗糖溶液可增加细胞对质粒的摄人。

(8)动物模型的选择及免疫周期和免疫次数。可选择小鼠(BALB/c、C57BL/6、H-2K、

H-2b品系)、树胸、鸡、兔、羊、猪、猴和猩猩等病原体易感动物作为模型，免疫周期为4~6周，免疫次数以1一3次为佳。

(9)免疫佐剂。细胞因子(IFN-Y、IL2、IL2和GM-CSF等)、脂质体和粘附分子(ICAM)

等都可作为核酸疫苗的佐剂。

(10)免疫保护效果的检测。可检测体液免疫和细胞免疫功能。

(11)可采用PCR技术检测转入的DNA在局部组织的存在情况；用免疫组织化学法检测

抗原蛋白的局部表达。

(12)对以上步骤取得的结果进行评价和分析。

二、免疫接种途径

目前很多实验室都在对用传统的针头皮内注射质粒DNA的方法进行研究。用皮内注射

方法得到的结果在抗原表达和被试动物的种属间有很大差别。以流感病毒的P为例，尽管

皮内注射能诱发抗体反应和CTL反应，但在对比肌肉或皮内两种接种途径的保护效果的实验

中显示，皮内注射总体的保护效果欠佳。在研究使用编码3种不同疟原虫抗原基因(CSP、

SSP2、HEPI7)的质粒DNA,用皮内和肌肉两种方法给药均能保护小鼠；相对地，皮内途径使

小鼠体内针对SSP2的抗体反应最强，而肌肉途径可使针对CSP和HEPI7的抗体反应较强。

由此可见，不同抗原基因的免疫保护效果可随接种途径的不同而产生差异。

Tang等在小鼠上应用了一种本来用于转染植物细胞研究的技术，名日“biolistic免疫”。

在该方法中，DNA被裹上蚀态金颗粒，然后以水蒸气或压缩气体膨胀为动力，将准备好的

DNA射入目的细胞。Webster等用了流感毒株一APR834在雪貂上做了biolistic免疫的

研究。在这个实验中，病毒排放孢子的量被用作衡量免疫力的程度。结果显示，用HA的

DNA以biolistic法免疫雪貂，遂用病毒攻击，在感染的3.5d后可发现病毒排放孢子被抑制；然而，一些病毒的复制还是可以进行的，因为在受到激发后，所有动物血清中抗体的效价明显上升。biolistic免疫也可以诱发细胞介导的免疫反应。Hui等在将组织经外科手术暴露后用肌肉或脾内的方法免疫小鼠MHC抗原H-2kb基因可产生特异性CTL。比较biolistic免疫和皮内注射这两种方法在流感NP诱生CTL的研究表明，用传统针头皮内注射1gDNA不能诱生CTL,而用基因枪注射16ng的DNA即可诱生CTL。

在小鼠体内用肌内注射和基因枪注射法分别注射编码人谷丙转氨酶的DNA,结果显示，

通过基因枪注射16ng的DNA比肌肉注射1g的DNA诱导产生的抗体效价高。许多研究

人员也试图用无针头的注射器来进行DNA免疫。这些装置使疫苗在压缩气体驱动活塞造成

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的高压下成为一股极细的液体流。这股液体流可以穿透组织且已在临床上用于注射传统疫苗

和药物（如胰岛素），但这一技术易使DNA因受显著的剪切力而发生构象及结构上的变化，在

使质粒渗透到深层肌肉中的技术上也存在一定问题。另外，对除注射以外的免疫接种途径也有必要进一步研究。

三、核酸疫苗载体中的非编码免疫刺激序列的免疫佐剂功能

免疫刺激序列(immunostimulatory sequences,ISS)由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)

为基元组成。在核酸疫苗的质粒载体DNA骨架中，氨苄抗性基因的两个5'AACGTT3'序列

就是具有较强活性的ISS。此结构在细菌DNA中的比例较高，而在脊椎动物DNA中比例较

低，并且，脊椎动物中8O%以上的CpG均被甲基化。脊椎动物DNA和细菌DNA的这种显著差别可能是使CpG序列成为免疫刺激信号的基础。ISS可作用于多种免疫活性细胞。1995年，Kieg和Yi等发现，经CpG刺激后95%的B细胞进入细胞增殖期，并分泌lgM和IL6。在体外将ISS作用于人单核/巨噬细胞可显著增加细胞中IFN-a、IFN-B、IL12以及IL18的mRNA表达。这些细胞因子的分泌可促进NK细胞活化和IFN-Y的合成，并使Th前体细胞向Th1细胞分化。

四、临床或临床前研究的核酸疫苗(一)核酸疫苗用于病毒性疾病

1.流感病毒(influenza virus)核酸疫苗最早用于流感病毒的研究。1993年Robinson等

将编码流感病毒血凝素(HA)的质粒DNA肌注小鼠和鸡，动物体内产生了特异性的拉HA抗

体，并使动物能抵御致死量流感病毒的攻击。甲型流感病毒常发生变异，使原有的疫苗对新毒株不起作用。Ulmer等选择甲型流感病毒中保守的核蛋白(NP)基因制备核酸疫苗，给小鼠肌

注疫苗，诱导出抗NP的特异性抗体和CTL反应，同时，免疫鼠能抵抗异型病毒的攻击。

2.乙肝病毒(hepatitis B virus)乙肝是世界上流行最广的疾病之一。1993年，Davis将含乙肝表面抗原(HBsAg)基因的质粒给小鼠注射，小鼠产生了HBsAg抗体。1994年Davis将HBsAg的三个邻近区域(pre-S1,preS2,S)的基因给小鼠单个注射和联合注射，诱导了全面的体液和细胞免疫应答。有关增强乙肝核酸疫苗效果和保护性免疫应答的研究尚在进行中。

3,人类免疫缺陷病毒(HIV)艾滋病的治疗是人类尚未攻克的难题，因而其预防极为重

要。1993年Wang等给小鼠和非人类灵长目动物肌注HIV包膜蛋白(env)的核酸疫苗，动物

体内产生了特异性抗体和CTL应答。产生的中和抗体能在细胞外抑制HV介导的合胞体的

形成及CD4与gp120的结合。表明env基因可在宿主肌细胞内表达和加工，表达产物gpl60被切割成gpl120和gD41后，可折叠成天然构象，从而诱导全面的免疫应答。Boyer等将gPl60和rev蛋白基因、gag和pol蛋白基因注射猩猩，其体内产生了体液和细胞免疫应答。用HIV攻击后1年，猩猩血中病毒仍为阴性。核酸疫苗为攻克艾滋病带来了希望。

4.狂犬病毒(rabies virus)狂犬病毒侵犯所有哺乳动物，给人类健康带来极大的威胁。目前最有效的疫苗是人二倍体细胞疫苗。1994年Xiang等将编码糖蛋白的质粒接种小鼠，小鼠产生了全面的免疫应答并获得了保护作用。Lo Dmel等在非人类灵长目动物中将核酸疫苗和人二倍体细胞疫苗作了比较，发现二者的免疫效果相似，这就为狂犬病的防治开辟了一条新途径。

在其他病毒感染的核酸疫苗研究中，如牛疱疹病毒(BHV)gD、gB糖蛋白、丙肝病毒(HCV)核蛋白、新城疫病毒(NDV)F蛋白、轮状病毒(Rota virus)VP4,VP6,VP7蛋白、淋巴细

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胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)核蛋白、人类巨细胞病毒(HCMV)膜蛋白、牛腹泻病毒糖蛋白

g即53，兔乳头状瘤L1蛋白、圣路易型脑炎病毒E蛋白核酸疫苗的研究中，这些核酸疫苗均能诱导全面的免疫应答，大部分免疫动物模型获得了保护。

(二)核酸疫苗用于细菌性疾病

1.结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)全世界每年约有300万人死于结核，BCG是最常用的疫苗。Huyen和Bonat分别将Ag85、hsp65蛋白的核酸疫苗免疫小鼠后，使其产生了全面的免疫应答，并能抵抗结核杆菌的攻击。Tascon等证实hsp65核酸疫苗与BCG获得的保护作用相似。另外，关于hsp70、ESAT等蛋白的核酸疫苗的实验研究也有相继报道。

2.破伤风杆菌(Clostridium tetani）破伤风杆菌感染率较高，每年全世界大约有40万人死于本病。破伤风一旦发病，治疗效果不佳，因而预防极为重要。破伤风毒素C蛋白(tet

C)是破伤风毒素C末端的非毒性区域，也是一个很好的候选抗原。Anderson等将C蛋白核酸

疫苗免疫小鼠，小鼠产生了抗C片段的免疫球蛋白和细胞免疫应答。免疫小鼠能抵抗致死量

破伤风毒素的攻击。

3.肺炎球菌(Streptococcus pneumonia）肺炎球菌肺炎，占细菌性肺炎的90%~95%。

肺炎球菌PSPA蛋白是细菌表面的一种蛋白质，在小鼠实验中已经证明可产生良好的免疫力。

MoDaniel等将含PSPA基因的质粒免疫小鼠，ELISA检测证实血清中产生较高的抗体水平。在攻击实验中，发现免疫小鼠血中肺炎球菌数目明显低于对照组，说明核酸疫苗产生了保护作

用。此外，幽门螺旋杆菌、空泡毒素、布鲁菌C712蛋白、伤寒杆菌外膜蛋白等核酸疫苗的研

究表明，这些疫苗均产生了一定的保护作用。

(三)核酸疫苗用于寄生虫感染性疾病

1.疟原虫(Plasmodium yoelii)全世界每年约有20亿~50亿的人感染疟原虫，每年有100万~200万人死于疟疾。传统的经放射处理的子孢子疫苗远不能满足如此庞大的感染群。

Hoffman等将疟原虫环子孢子核酸疫苗免疫小鼠，小鼠体内产生了抗环子孢子特异性抗体和CTL应答，并使小鼠获得了保护作用，他们证实了这种保护作用依赖于CD8+T细胞。Dodan

等阐明环子孢子核酸疫苗产生的保护作用依赖于CD8*T细胞、IFNY及含氮化合物等。他们

还证实了核酸疫苗在不同品系的小鼠中产生的保护作用不同，这表明核酸疫苗的效果受多种因素的影响。

2.利什曼原虫（Leishmania)利什曼原虫gp63蛋白是一种保守性较高的糖蛋白。Xu等将gP63蛋白的核酸疫苗接种BALB/c小鼠，使小鼠获得了保护作用。免疫小鼠脾细胞经体

外诱导，可产生高水平的IL2和IFN-Y,说明细胞免疫与保护性免疫极为相关。

3.日本血吸虫和猪带绦虫血吸虫和绦虫均属扁形门寄生虫，两者有很高的同源性。副肌球蛋白是无脊椎动物中比较保守的蛋白，它参与补体的调节反应。Yang等将日本血吸虫副肌球蛋白核酸疫苗肌注小鼠，小鼠产生了部分亚型的抗体(IgG1,IgG2a,IgG2b),攻击实验中小鼠没有获得保护作用，这可能是没有产生IgE和IgA等保护性抗体的缘故。猪囊虫病在我国流行甚广，孙树汉等将cC蛋白和副肌球蛋白质粒接种小猪，在小猪体内诱发了体液免疫和细胞免疫，cC疫苗使小猪获得了保护作用，副肌球蛋白核酸疫苗保护作用的研究尚在进行之中。此外，伯氏螺旋体、弓形体、肺炎支原体等核酸疫苗的研究结果也有相继报道。

(四)核酸疫苗在肿瘤中的实验研究

Cony等将含人癌胚抗原(CEA)的质粒免疫小鼠，获得了针对CEA的特异性细胞和体液

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免疫应答，并保护小鼠抵抗表达CEA同系肿瘤细胞的攻击。编码多形上皮粘蛋白(PEM)的

MVCI基因与乳腺癌、胰腺癌、结肠癌相关。Teyllor等将MVCI核酸疫苗免疫小鼠，使小鼠获得了保护作用。这些研究成果均显示核酸疫苗在肿瘤防治中具有潜在的应用前景。

（五)其他

核酸疫苗还在自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎和Ⅰ型变态反应的防治中得到应用。

第三节核酸疫苗研制中面临的机遇

对疫苗技术而言，可从以下两个方面评估其成功与否：一是使临床上显见疾病得到预防的数目；二是看这项技术在人群中应用的水平。一个成功的疫苗技术必须满足以下几个要求：①这项技术能激发恰当的免疫反应来降低个体的发病率和死亡率。因为既然不是所有人都能接种疫苗，且不是所有接种的人都被保护，所以这就要求有一种疫苗技术，它能使接种产生的保护性自始至终地防止病原体再次进入人体，达到从整体上保护人群的目的：②这项技术必须非常安全，这样在大规模接种健康个体时可以避免不必要的麻烦；③这项技术还要有一定的伸缩性，这样才可以区别病原体上的各种抗原，防止各种新的、变异的抗原的人侵；④这项技术必须适用于抵抗许多种靶病原体。从这四个角度来分析以前使用的疫苗技术可以看出，不论是减毒疫苗、火活疫苗、亚单位疫苗等均有这样或那样的不足，因此，一种新疫苗的出现并在相应领域中充分发挥作用已成必然。

一、核酸疫苗的优势

核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势：

(1)诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用：

(2)无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性；

(3)能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性；

(4)与亚单位疫苗共有的高产性；

(5)可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；

(6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；

(7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。

二、核酸疫苗的推广应用及亟待解决的问题

核酸疫苗的上述优势将给免疫接种带来一次伟大的变革。从理论上讲，迄今所有用于主动免疫的第一、二代疫苗和用于被动免疫的球蛋白都可完善成效果更加理想的核酸疫苗，尚无疫苗，也无其他良好预防措施的其他诸多感染性疾病乃至肿瘤或遗传性疾病，均可通过筛选到良好的保护性抗原之后完善成有效的核酸疫苗用于这些疾病的防治。

核酸疫苗的免疫机制已被多数学者所接受，其应用潜力也得到了世界各国的重视。美国

DA已批准流感、结核、疟疾、乙肝等数种核酸疫苗做临床应用实验，其中结核核酸疫苗和疟

疾核酸疫苗获准生产。我国也有10余种核酸疫苗进人了临床前研究，在最近一二年内将会有

一批核酸疫苗获准做临床应用实验。这预示着核酸疫苗将成为今后人类与疾病特别是感染性

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···试读结束···